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THEMA: Luftstrom mit UV-C statt HEPA

Luftstrom mit UV-C statt HEPA 12 Apr 2018 06:57 #8320

Hallo,

ich habe fleissig gelesen und getan und gemacht und auch meine ersten Petris funktionieren für ohne sterilem Luftstrom recht gut. Aaaaaber..... wenn ich eine Luftansaugung über ein Grobfliess mache, dahinter einen Raum mit der Luft durchströmen lasse, welcher mit 15W UV-C bestrahlt wird, dann sollte doch hinter einem weiteren Fliess ein steriles Arbeiten möglich sein, oder nicht? Ich meine das sollte doch wirkungsvoller sein als dieser Hokuspokus zwischen zwei Bunsenbrennern oder ähnlichem.

Hintergrund: Ich würde eigentlich gerne gerne auf den teuren HEPA verzichten, gerade auch um wiederum am Lüfter zu sparen. Die Geschichte soll in etwa eine 'undichte Glovebox' werden, wo es an gezielten Stellen (unterhalb und zwischen den Handschuhen) die Luft wieder rausdrückt weil eine sterile Luft nachgepresst wird.

Ich freue mich schon auf Eure Gedanken,

Magnus alias Schwammerlkopf
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Luftstrom mit UV-C statt HEPA 12 Apr 2018 12:37 #8323

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Meiner Meinung nach totaler Overkill wenn es dir rein ums Arbeiten mit Petrischalen geht.
Dabei reicht bei sauberer und zügiger Arbeitsweise ein Bunsenbrenner vollkommen aus.
Arbeitsplatte desinfizieren, Hände desinfizieren, darauf achten dass es keinen Luftzug gibt. Ich gieß meine Petris auch auf der Steinplatte in der Küche. Mache das zwar erst seit kurzem, aber habe jetzt bei 5-6x Gießen in den letzten Monate keine einzige Bakterielle Kontamination oder Schimmel auf dem Agar gehabt, mit einer Ausnahme: dem Ausplattieren von Sporenlösung mit Drigalskispatel. Nachdem die aber nicht steril ist, war das natürlich zu erwarten ;)

Ich verpacke die Petrischalen vor dem Sterilisieren im DDKT verkehrt in einem PP Eimerchen (1L da gehen 7 rein). Das verschließe ich mit Alufolie. Nach dem Sterilisieren stelle ich den Eimer kopfüber auf die Steinplatte (Mit einem Stück Küchenrolle darunter. --> Jetzt stehen die Platten richtig herum als kleiner Stapel unter dem Eimer.
Dann sterilisiere ich die Agarlösung und lasse sie noch im Kochtopf etwas abkühlen. Wenn man zu heiß gießt hat man viel Kondenswasser.
Nun Brenner anmachen, Eimer abheben, Platten im Turmgussverfahren gießen, Eimer wieder drüber stellen und abkühlen lassen.

Ich lasse die dann gerne so 2-3 Tage stehen. Das hat zum einen den Vorteil dass das Kondenswasser dann wieder in den Agar einzieht, und zweitens würde man nach der Zeit auch eventuelle Kontaminationen schon sehen.

Turmgussverfahren sieht so aus, dass du den Petrischatestapel von unten nach oben eine nach der anderen gießt wie z.B. hier zu sehen ist:


Die Sterilwerkbank unter dem Abzug brauchts dafür nicht. In den Mikrobiologie und Bakteriengenetik Labors haben wir auf der Uni die Platten auch ganz normal auf der Steinplatte gegossen und hatten auch fast keine Ausfälle... und das waren pro Labor jeweils 40-50 Platten oder noch mehr... je nachdem was gemacht wurde.

Dort wo du die Platten gießt darauf achten, dass darüber keine Regalflächen oder so sind, von denen man Staub aufwirblelt. Vorm Herumpatzen und Kontaminieren der Platten mit den Fingern schützt dich weder der UV Strahler noch der Luftfilter. Wobei der UV Strahler sicher als nachträgliche Desinfektion nach dem Gießen ganz lässig ist. Vor allem damit außen auf den Schalen nicht so viel Keime drauf sind. Ob das dann im Endeffekt wirklich was bringt, kann ich dir nicht sagen.

Ich kann jedenfalls (als halber Molekularbiologe) nach 3 Monaten Herumlaborieren in der eigenen Küche sagen, dass das sterile Arbeiten zu Hause mit relativ wenig Aufwand erstaunlich gut funktioniert. Und es macht auch irgendwie Spaß. Was ich persönlich als wichtig empfinde ist, dass man sich jeden Arbeitsvorgag vorher Handgriff für Handgriff genau durchdenkt und alles wo Kontaminationen auf Medium oder Nährboden kommen kann minimiert (Zeiten die die Petris geöffnet sind, Anfassen der Schalen, usw.)
Dazu gehört auch alles vorher Abzuflammen womit man Kontis übertrage kann. Also Glasränder, Impfösen, Pinzette usw....

Viel Erfolg jedenfalls.
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Luftstrom mit UV-C statt HEPA 13 Apr 2018 20:01 #8335

Hola,

mir ging es nicht nur ums Petris herstellen - das wäre ja doof, was sollte ich mit nicht beimpften Petris machen??? Übrigens koche ich Agar-Agar im Topf, fülle Petris auf, schichte die versetzt im DDKT und autoklavier sie da drin. Wenn Topf abkühlt kommt ein nasses Zewa frisch von der Rolle auf das Einlassventil und wenn der DDKT kalt ist, werden die Petris rausgeholt und umgehend mit 6cm breiter Frischhaltefolie eingewickelt (Die Ränder).

Um meine Gesamtsituation besser verstehen zu können, definiere ich mal die Gegebenheiten:
- Küchentisch, Mundschutz, Desinfektionsspray (Aus der Apo meiner Frau), DDKT, Spiritusflamme, Skalpell (Gutes aus Metall mit aufsteckbaren Ersatzklingen)
- Agar Agar, die erste Ladung war ein Produkt vom Roßmann, welches aus 30% Agar Agar und 70% Maltodextrin bestand. Von diesem wurden 15g auf 200ml Leitungswasser eingerührt (Stark Kalkhaltig, sonst sehr hochwertig, wir haben in unserer Gemeinde eine der drei Münchener Leitungswasserquellen). Die Zweite Ladung war reines Agar Agar, welches ich wie folgt anrührte: 2g Agar, 2g dunkles Malzextrakt, 0,2g Trockenbackhefe mit 100ml Leitungswasser und dann nocheinmal 2g Agar, 1g dunkles Malzextrakt, 1g helles Malzextrakt und 0,2g Trockenbackhefe mit 100ml Wasser. Und ja, dank der Rezepturwaage der Apo meiner Frau wurden es relativ genau 0,2g ;-).
- Austernmyzel aus der "Bio Home-Pilzzuchtset"-Box von Pilmännchen, Champignon-Brut von Amazon und Shiitake-Brut von Amazon.

In einer ersten Impfaktion habe ich aus Frauchens Pilzmännchen-Box Austern-Myzel für 4 Petris (Eine Art MEA mit dem Maltodextrin) geklaut. Von diesen 4 hatte eine Petri zu wenig Nährboden (Der Topf war leer :-( ;-) ), eine wirkt sauber und zwei wirken kontaminiert aber nicht überwuchert.

In einer zweiten Impfaktion habe ich je Pilzsorte (Drei Sorten) drei Petris vorbereitet, je eine mit dieser Art MEA und je eine mit meinen MYA's mit dunklem Malzextrakt und 50/50 hellem und dunklem Malzextrakt. Als Basis galten die eine saubere Austern-Petri und die zwei erworbene Pilzbruten mit Shiitake und Champignon. Ergegbnis: Die Auster ist wieder zwei mal kontaminiert (Glaube ich zu wissen, hellbrauner Schleim auf dem doch dunklen Nährboden) und wächst auf dem Art MEA scheinbar langsam aber sauber. Die Champignons sind - vermute ich - zwei mal mit Grünschimmel und einmal mit Schleimibäh infiziert. Begeistern tut mich dagegen der Shiitake, der ist drei mal sauber, jedoch wächst er auf dem MEA wenn dann nur unmerklich. Auf dem MYA mit 50% hellem Malzextrakt geht der Shiitake ab und auf dem dunklem MYA explodiert er förmlich.

Ich will eine solche Box um 'freier' arbeiten zu können. Sprich evtl. aus den infizierten Petris eine saubere Probe selektieren zu können und nicht den Deckel so schnell wie möglich zuschlagen zu müssen um eine Konti zu verhindern. Und ich will die Kontis minimieren und auch die Wahrscheinlichkeit senken, dass es im Falle einer Konti mein Fehler beim Arbeiten war. Die Idee ist, ein auf der Seite liegendes Aquarium mit einem Deckel auszustatten. Dieser Deckel hat zwei Öffnungen für die Grabscherle, oberhalb der Arme einen Einlass für ein Rohr (120mm), in diesem Rohr die 15W-UV-Birne. Über einen kleinen Lüfter wird die Luft um die UV-Lampe geblasen und anschliessend in dieses Aquarium gedrückt. Über eine Reihe kleiner Löcher ganz unten an diesem Deckel (knapp über der Arbeitsoberfläche), soll die Luft wieder entweichen können (Der Venti braucht eine höhere Kapazität als die kleinen Löcher entweichen lassen können). Die Grabscherle sollen ganz Fetisch-Like in lustige Gummi-Anzüge (Handschuhe) gesteckt werden.

Ich hoffe niemand nimmt mir meine Art, lustig durch die Welt zu gehen, krumm, dennoch ist mir die Materie wichtig, nur bin ich der Meinung, dass das Leben zu ernst ist, um ohne Humor durchzulaufen :-)

Viele Grüße,

Magnus alias Schwammerlkopf
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Luftstrom mit UV-C statt HEPA 13 Apr 2018 20:20 #8336

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Hmmm also ich denke Mundschutz ist nicht wirklich notwendig, schadet aber nicht.

Das Autoklavieren der Platten NACH dem Gießen habe ich zu Anfang auch gemacht, aber das wird ein einziges Desaster mit dem Kondenswasser. Sobald du da Tropfen am Nährboden hast, kannst du eine Kontamination nicht mehr vom eigentlichen Myzel unterscheiden weil das alles irgendwie eine verschwommene Matschangelegenheit wird. Da war bei meinem ersten Versuch von 5 Petris genau eine zu gebrauchen, der Rest Aquarium.
Habe dann mal bei unserer Laborexpertin nachgefragt und die hat mich nur entgeistert angesehen und gesagt: "Nach dem Gießen Autoklavieren? Das macht NIEMAND so!" ^^

Ich mache beim Agarkochen jetzt immer 200ml weil 100 ein wenig unhandlich sind. 5g reines Agar Agar (Amazon), 4g irgendein Malzextrakt das aussieht und schmeckt wie Honig, ein paar Tropfen Mineralienlösung (ich verwende Osmosewasser).

Wenn du Kontis hast, musst du immer überlegen woher die kommen könnten. Wenn die exakt dort sind wo do animpfst, dann ist entweder dein Impfmaterial von vornherein nicht sauber, oder ein Arbeitsschritt ist fehlerhaft.

Wenn die Kontis irgendwo verteilt auf den Platten auftreten dann kommt vielleicht was über die Luft (Staub) rein oder das Sterilisieren funktioniert nicht.

Viel mehr Möglichkeiten gibts da wohl nicht.

LG
Stefan
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Luftstrom mit UV-C statt HEPA 14 Apr 2018 06:57 #8338

Hola,

sagen wir mal so, ich habe es schon früher mal ohne Mundschutz versucht und das einzige was ich aktuell geändert habe, war der Mundschutz und plötzlich funktioniert irgendwas ;-).

Ich werde mal die Plattengiess-nach-autoklavieren-Technik versuchen. Wie autoklavierst Du denn den Nährboden?

Bei Teilen der Austern und dem einen Champignon bin ich mir noch nicht einmal sicher, ob es wirklich eine Kontamination ist oder nicht vielleicht doch aufgeweichter Nährboden im Kondenswasser. Daher vermute ich auch: Wenn Konti dann vom Kondenswasser, welches mir die Konti vom Rand in die Mitte getragen hat. Aber bei dem Grünschimmel bin ich mir relativ sicher, dass der bereits auf der Brut war, da immer die Brut selbst grün wird bzw. der Nährboden dort grün wird, wo ich vorher das Brutkorn drübergezogen habe.

Ich verwende übrigens trockenen Malzextrakt aus der Backwarenabteilung (Ich backe mein Brot selber und Malzextrakt macht selbiges fluffiger, weil die Hefe im Sauerteig so auf das Malzextrakt abgeht).

Viele Grüße,

Magnus alias Schwammerlkopf
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Luftstrom mit UV-C statt HEPA 14 Apr 2018 08:06 #8339

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Ich hatte auch den Grünschimmel in der Brut, weil ich unter anderem auch die falsche Brut gekauft habe. Nämlich die für outdoor Animpfen von Baumstämmen oder Strohballen.
Beim ersten Versuch war nach 5 Tagen der Schimmel da. Da habe ich vermutet dass ich zu wenig sterilisiert habe, bzw. dass das Substrat subotimal war.
Im zweiten Versuch habe ich dann 2-fach sterilisiert und das doppelt so lange --> Wieder nach 5 Tagen Schimmel, auffälligerweise immer genau auf dem Impfmaterial und nicht auf meinem Substrat. Da habe ich dann ein kleines Stck vom eigentichen Pilzmyzel, das möglichst weit weg vom Schimmel war auf Petrischale übertragen. Nachdem es angewachsen war habe ich davon wieder ein winziges Stück vom Rand auf eine weitere Petrischale übertragen und damit ist es mir dann gelungen den Stamm den ich haben wollte zu isolieren. Nachdem ich dann damit direkt von Agar angeimpf hatte war kein Schimmer mehr in den Kulturen.

Wie ich meine Nährböden herstelle hatte ich ja schon in meiner ersten Antwort in dem Thread beschrieben. Petrischalen verpacken und sterilisieren. Agar abmischen und sterilisieren. Agarlösung verschlossen etwas abkühen lassen und dann neben der Gasflamme gießen. Mundschutz kan sicher nicht schaden, aber ich verwende keinen und in den abors auf der Uni hab ich auch noch keinen damit arbeiten sehen. Dass man, wenn man die Petrischalen öffnet nicht redet oder auf die Platten atmet versteht sich von selbst ;)
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